Ṣatunkọ nipasẹ Peter Sarnow, Ile-iwe Oogun University Stanford, Ile-ẹkọ giga Stanford, California, ti a fọwọsi ni Oṣu kejila ọjọ 25, Ọdun 2020 (ayẹwo ni Oṣu Kẹwa Ọjọ 25, Ọdun 2020)
A ṣe ijabọ ibaraenisepo laarin awọn ipin ninu ẹda ti awọn ile-itumọ coronaviruses, eyiti o ṣe pataki fun ẹda-pada ati itọju itiranya.A pese ẹri pe agbegbe NiRAN ti o ni nkan ṣe pẹlu nsp12 ni o ni nucleoside monophosphate (NMP) iṣẹ gbigbe ni trans, ati pe nsp9 (protein abuda RNA) ṣe idanimọ bi ibi-afẹde rẹ.NiRAN ṣe itọsi asomọ covalent ti nkan NMP si ebute amino nsp9 ti o tọju ni iṣesi ti o gbarale awọn ions Mn2+ ati awọn iṣẹku Asn ti o wa nitosi.A rii pe iṣẹ NiRAN ati nsp9 NMPylation jẹ pataki fun ẹda coronavirus.Data naa gba wa laaye lati sopọ iṣẹ ṣiṣe ti ami ami-ami ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ si awọn akiyesi išaaju ninu idawọle pe ibẹrẹ ti iṣelọpọ RNA ni kilasi ti awọn ọlọjẹ RNA jẹ iṣẹ ṣiṣe ati ni ibamu pẹlu itiranya.
RNA polymerase (RdRps) ti o gbẹkẹle RNA ti Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ati awọn idile 12 miiran) ni asopọ si aaye amino-terminal (N-terminal) ni amuaradagba ti kii ṣe igbekale (nsp) ti a tu silẹ lati polyprotein, ti a pe ni NiRAN 1ab ti kq ti gbogun ti akọkọ protease (Mpro).Ni iṣaaju, ọlọjẹ iṣọn-ẹjẹ NiRAN-RdRp nsp ti ara GMPylation/UMPylation ti ara rẹ ni a royin, ati pe o daba lati ṣe agbejade igba diẹ fun gbigbe ti nucleoside monophosphate (NMP) si ọlọjẹ (aimọ lọwọlọwọ) ọlọjẹ ati / tabi awọn nkan bioopolymerization sẹẹli.Nibi, a fihan pe coronavirus (Human Coronavirus [HCoV] -229E ati Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ni iṣẹ NMPylation ti o gbẹkẹle Mn2+, eyiti o jẹri lati nsp9 nipasẹ dida Mpro-mediated nsp9 Lẹhin awọn N-terminal flanking nsps ti wa ni idasilẹ proteolytically, phosphoramidate ti wa ni asopọ si amine akọkọ (N3825) ni N-terminal ti nsp9.Uridine triphosphate jẹ nucleotide ti o fẹ julọ ninu iṣesi yii, ṣugbọn adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, ati triphosphate cytidine tun jẹ awọn sobusitireti to dara.Awọn ijinlẹ iyipada nipa lilo coronavirus nsp9 recombinant ati awọn ọlọjẹ nsp12 ati awọn ẹda HCoV-229E ti a ṣe ni ipilẹṣẹ pinnu awọn iṣẹku ti o ṣe pataki fun NMPylation NMPylation ti NiRAN-mediated ati ẹda ọlọjẹ ni aṣa sẹẹli.Awọn data timo awọn asọtẹlẹ ti NiRAN awọn iṣẹku ojula ati pinnu awọn pataki ipa ti nsp9 N3826 iṣẹku ni nsp9 NMPylation ati kokoro atunse ni vitro.Iyoku yii jẹ apakan ti ọna N-terminal NNE tripeptide ti o tọju ati fihan pe o jẹ iyọkuro ailẹgbẹ nikan ti nsp9 ati awọn homologs rẹ ninu idile coronavirus.Iwadi yii n pese ipilẹ to lagbara fun iwadi iṣẹ ṣiṣe ti iṣẹ NMPylation ti awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ miiran ati gbero awọn ibi-afẹde ti o ṣeeṣe fun idagbasoke awọn oogun antiviral.
Nidovirales rere-stranded RNA virus npa ọpọlọpọ awọn vertebrates ati invertebrates (1, 2).Aṣẹ lọwọlọwọ pẹlu awọn idile 14 (3), eyiti eyiti idile Coronavirus ti ṣe iwadi lọpọlọpọ ni ọdun 20 sẹhin.Ni akoko yẹn, awọn coronaviruses zoonotic mẹta jade lati awọn ọmọ ogun ẹranko ati fa awọn ibesile nla ti awọn akoran atẹgun nla ninu eniyan.Pẹlu awọn ajakalẹ-arun ti o tẹsiwaju ti o fa nipasẹ awọn arun ajakalẹ-arun nla.Aisan atẹgun Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses ṣe alabapin ajọ-ara jiini ti o wọpọ, ati ipin ti eka-itumọ-igbasilẹ ti ara ilu (RTC) ti wa ni koodu ni 5-?²-terminal meji-meta ati ipin ipilẹ akọkọ ti patiku ọlọjẹ, ati diẹ ninu awọn ẹya ẹrọ. .Amuaradagba, ti a fi koodu si ni 3??² opin kẹta ti jiometirika (1).Ayafi fun idile kan ti awọn ọlọjẹ planarian (Monoviridae) (8), gbogbo awọn ọlọjẹ onitẹ-ẹiyẹ ṣe koodu awọn ipin RTC ni awọn fireemu kika kika nla meji (ORF) ORF1a ati ORF1b, eyiti o tumọ lati genomic RNA ti.ORF1a ṣe koodu koodu polyprotein (pp) 1a, ati ORF1a ati ORF1b koodu ni apapọ pp1ab.Pẹlu ikopa gbogbogbo ti protease akọkọ (Mpro) ti a fiwe si nipasẹ ORF1a, mejeeji pp1a ati pp1ab ni a ṣe ilana ọlọjẹ sinu ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ ti kii ṣe igbekale (nsps), ti a tun mọ ni 3CLpro, nitori pe o ni homology pẹlu 3Cpro ti picornavirus ( 9).Awọn nsps wọnyi ni a ro pe wọn pejọ sinu RTC ti o ni agbara nla, ṣe itusilẹ iṣelọpọ ti RNA jiini (atunṣe) ati ṣeto ti RNA subgenomic (transcription), ati pe a lo lati ṣajọpọ ikosile ti ORF ti o wa ni isalẹ ORF1b (10? ? ?12).
RTC mojuto pẹlu RNA-ti o gbẹkẹle RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) ati ọpọlọpọ awọn enzymu sisẹ RNA, eyiti o jẹ koodu ni pataki ni ORF1b ati ninu idile coronavirus O ni nsp12-nsp16 ati nsp9-nsp12 ninu idile Arterioviridae (wo itọkasi 10ââ 12).RdRp ati HEL1 ṣe aṣoju awọn ibugbe meji (ẹẹkan-karun) ti kokoro itẹ-ẹiyẹ ẹyẹ ati pe wọn ni isomọ laarin awọn ọlọjẹ RNA miiran.Atunse Core ni a gbagbọ pe o ṣe iranlọwọ nipasẹ awọn ipin-ipin miiran, pẹlu ọpọlọpọ awọn nsps kekere ti a tu silẹ lati agbegbe carboxy-terminal (C-terminal) ti pp1a, ni isalẹ ti Mpro (coronavirus nsp5 ati ọlọjẹ arterial nsp4, lẹsẹsẹ).Wọn ni aabo ti idile kan ti o ni opin ati awọn iṣẹ oriṣiriṣi (ayẹwo ni itọkasi 10ââ12).
Ni ibatan laipẹ, agbegbe kan ti o ni awọn abuda agbaso ara oto ni a rii ni amino terminus (N-terminus) nitosi RdRp ni gbogbo awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ, ṣugbọn ko si awọn ọlọjẹ RNA miiran (16).Da lori ipo rẹ ati nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), orukọ agbegbe yii ni NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Apapọ-ašẹ meji ti NiRAN-RdRp jẹ nsp12 ninu idile Coronaviridae ati nsp9 ninu idile Arterioviridae, ati ninu awọn nestoviridae miiran, NiRAN-RdRp ni a nireti lati tu silẹ bi nsp ominira lati ọlọjẹ polyprotein.Ninu coronavirus, agbegbe NiRAN ni awọn iṣẹku 1/450 ati pe o ni asopọ si agbegbe C-terminal RdRp nipasẹ agbegbe asopọ (16?19).Ni Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), recombinant nsp9 fihan Mn2 + ion-dependent (ara) UMPylation ati awọn iṣẹ GMPylation, eyiti o dale lori awọn ipilẹ ti o tọju mẹta ni nestovirus, AN, BN ati CN Awọn iyokù ti o wa ninu ọkọọkan.Nibo N duro fun NiRAN) (16).N-terminal flanking ti awọn wọnyi motif jẹ kan kere Konsafetifu agbaso preAN.Diẹ ninu awọn iṣẹku wọnyi tun ni ipamọ ni awọn kinases amuaradagba ti o ni ibatan ti o jinna, nibiti wọn ti fihan pe wọn ni ipa ninu abuda triphosphate nucleoside (NTP) ati iṣẹ ṣiṣe catalytic (20, 21).Ni ibamu pẹlu akiyesi yii, ọpọlọpọ awọn iṣẹku aaye ti nṣiṣe lọwọ bọtini ni pseudokinase SelO lati Pseudomonas syringae le ṣe apejọ pẹlu SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomplex ti a tẹjade laipẹ.Awọn iṣẹku Coronavirus NiRAN ti a fipamọ sori ẹrọ ni microstructure elekitironi.Amuaradagba atunko (17).O ṣe akiyesi pe iwe-ipamọ (ara) U/GMPylation yoo ṣe agbejade ipo igba diẹ lati gbe NMP si sobusitireti (aimọ lọwọlọwọ) (16), ati ibajọra igbekalẹ laarin NiRAN ati protein kinase (17, 19) ) Njẹ arosọ pe NiRAN ṣe atunṣe awọn ọlọjẹ miiran.
Ọpọlọpọ awọn ẹya ara ẹrọ, pẹlu alailẹgbẹ ati isọdọkan eleto rẹ pẹlu awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ ati ipinya jiini lati RdRp, jẹ ki NiRAN jẹ enzymu ilana ilana bọtini ti o tọ fun awọn ọlọjẹ ti itẹ-ẹiyẹ, eyiti o ṣe pataki si ifarahan ati idanimọ wọn.Ni iṣaaju, awọn iṣẹ mẹta ti o ṣeeṣe ti o kan NiRAN lati ṣe ilana ilana genome/subgenomic tabi ẹda-itumọ ni a pe.Nigbati o ba n ṣakiyesi data ti ko pe ati pe ti o wa ni akoko naa, iṣẹ kọọkan ni awọn anfani ati awọn alailanfani rẹ (16).Ninu iwadii yii, a ni ifọkansi lati ṣajọpọ biokemika ati yiyipada awọn ijinlẹ jiini ti awọn coronaviruses ti o nsoju ẹda meji, ati fi awọn awari wa si ipilẹ itankalẹ ti iyipada ẹda ti idile coronavirus, lati ni oye si ijọba ohun ijinlẹ yii.A ṣe ijabọ awọn ilọsiwaju pataki ni oye ti NiRAN nipasẹ idanimọ ti awọn ibi-afẹde ti ara ni RTC, eyiti (laarin awọn idawọle mẹta ti o wa) ṣe alabapin si ipa ti agbegbe yii ni pilẹṣẹ iṣelọpọ ti ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ RNA.Iwadi yii tun ṣii awọn aye fun awọn ipa miiran ti NiRAN lori wiwo agbalejo ọlọjẹ.
Lati le ṣe apejuwe awọn ohun-ini enzymatic ti ọlọjẹ corona nsp12-ašẹ NiRAN ti o ni ibatan, a ṣe agbejade fọọmu isọdọtun ti coronavirus eniyan 229E (HCoV-229E) nsp12 ni E. coli, pẹlu aami His6 ni C-terminus, ati ni idapo amuaradagba pẹlu [α32-P] Incubate pọ pẹlu NTP ni iwaju MnCl2 gẹgẹbi a ti ṣalaye ninu Awọn ohun elo ati Awọn ọna.Onínọmbà ti ọja ifa tọkasi wiwa ti amuaradagba ti o ni aami redio pẹlu nsp12 (106 kDa), ti o nfihan pe coronavirus nsp12 n ṣe itusilẹ dida ti awọn amuaradagba covalent-NMP adducts, ni yiyan ti a ṣẹda pẹlu uridine monophosphate (UMP) (Figure 1A) Ati B).Atupalẹ pipo fihan pe ni akawe pẹlu awọn nucleotides miiran, kikankikan ifihan agbara ti isọdọkan UMP pọ si nipasẹ awọn akoko 2 si 3 (Aworan 1C).Data yii wa ni ibamu pẹlu iṣẹ-ṣiṣe gbigbe NMP ti asọtẹlẹ ti agbegbe NiRAN ti coronavirus (16), ṣugbọn tọka pe awọn yiyan nucleotide ti agbegbe NiRAN ti coronavirus ati ọlọjẹ iṣọn-ara yatọ.
Iṣẹ ṣiṣe NMPylation ti ara ẹni ti HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) jẹ idawọle pẹlu [α-32P] NTP ti a yan ni iwaju 6 mM MnCl2 fun awọn iṣẹju 30 (wo Awọn ohun elo ati Awọn ọna fun awọn alaye).Awọn ọja ifaseyin ti yapa nipasẹ SDS-PAGE ati abariwon pẹlu Coomassie didan buluu.(B) Amuaradagba ti o ni aami redio jẹ wiwo nipasẹ aworan phosphorous.Awọn ipo ti nsp12-His6 ati awọn ami ami ibi-ara molikula amuaradagba (ni awọn kilodaltons) ni a fihan ni A ati B. (C) Agbara ti ifihan ipanilara (itumọ ± SEM) ni a pinnu lati awọn idanwo ominira mẹta.P≤0.05.Agbara ifihan (ogorun) jẹ ibatan si UTP.
Botilẹjẹpe awọn iṣẹ enzymu ti o ni ibatan NiRAN ti han lati jẹ pataki fun isọdọtun ti EAV ati SARS-CoV ni aṣa sẹẹli (16), iṣẹ NiRAN pato ati awọn ibi-afẹde ti o pọju ko ti pinnu sibẹsibẹ.Ibajọra igbekalẹ ti a royin laipẹ laarin NiRAN ati ẹbi ti awọn ọlọjẹ pẹlu awọn agbo-ẹda protein kinase (17, 22) jẹ ki a ṣe idanwo idawọle ti NiRAN ṣe itọsi NMPylation ti awọn ọlọjẹ miiran.A ṣe ipilẹṣẹ ti awọn ibi-afẹde isokan ti o pọju, pẹlu awọn ọlọjẹ ti kii ṣe igbekale nipasẹ HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ọkọọkan ti o ni aami C-terminal His6 (Afikun SI, Tabili S1) , Ati ṣabọ awọn ọlọjẹ wọnyi pẹlu [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P] UTP) ni wiwa tabi isansa ti nsp12.Bovine serum albumin ati MBP-LacZα amuaradagba fusion ti a ṣe ni E. coli ṣiṣẹ bi awọn idari (Aworan 2A, awọn ọna 1 si 7).Awọn amuaradagba ti o ni aami redio ni a ṣe atupale nipasẹ sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ati autoradiography, ati pe a rii pe ifihan agbara ipanilara to lagbara wa ninu iṣesi ti o ni nsp12 ati nsp9.Ipo ti ifihan naa ni ibamu pẹlu iwọn molikula ti nsp9, ti o nfihan UMPylation nsp12-mediated ti nsp9 (Figure 2B, orin 7).Ko si awọn ọlọjẹ idanwo miiran ti a rii lati jẹ UMPylated, eyiti o mu wa pinnu pe nsp9 jẹ sobusitireti kan pato ti nsp12.Ni ibamu pẹlu data NMPylation ti ara ẹni ti o han ni Nọmba 1, nsp12 ni anfani lati gbe gbogbo awọn NMP mẹrin si nsp9, botilẹjẹpe iṣẹ ṣiṣe yatọ, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Aworan).3 A ati B).Labẹ awọn ipo ti a lo ninu igbelewọn yii (kukuru iṣesi ati akoko ifihan, dinku ifọkansi ti nsp12; awọn ohun elo ati awọn ọna), a ko le rii NMPylation ti ara ẹni ti nsp12 (fiwera Figure 2B, lane 7, ati Figure 1B), eyiti safihan doko (Ati ọpọ iyipo) UMP gbe lati nsp12 to nsp9.Iṣẹ ṣiṣe gbigbe UMP nilo wiwa awọn ions Mn2+, bi o ṣe han ni Nọmba 3C, lakoko ti iṣẹ gbigbe UMP ti o kere ju ni a ṣe akiyesi niwaju Mg2 +, ati pe ko si iṣẹ-ṣiṣe ni iwaju awọn cations divalent meji miiran ni idanwo.Awọn data ti o jọra ni a gba ni awọn ayẹwo NMPylation ti o ni cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), ati adenosine triphosphate (ATP) (SI appendix, Figure S1).
HCoV-229E nsp12-ilaja UMPylation ti nsp9.Orisirisi awọn sobusitireti amuaradagba (pẹlu serum bovine albumin, MBP-lacZα, ati lẹsẹsẹ HCoV-229E nsps ti a samisi pẹlu C-terminal His6 ti a ṣe koodu nipasẹ ORF1a) ni a lo lati ṣe iṣiro iṣẹ ṣiṣe UMPylation ti HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated amuaradagba.Ṣafikun amuaradagba pẹlu [α-32P] UTP fun awọn iṣẹju 10 ni isansa (A) tabi wiwa (B) ti nsp12 gẹgẹbi a ti ṣalaye ninu awọn ohun elo ati awọn ọna.Ni oke A ati B, SDS-polyacrylamide gel ti o ni abawọn pẹlu Coomassie Brilliant Blue ti han, ati ni isalẹ ti A ati B, awọn autoradiograms ti o baamu ti han.Ipo ti ami ami ibi-ara molikula amuaradagba (ni kilodaltons) ni a fun ni apa osi.Ipo ti nsp12-His6 (B, oke) ati ifihan agbara ipanilara ti a ṣe akiyesi lakoko idawọle ti nsp12-His6 pẹlu nsp9-His6 (B, lane 7) tun tọka si, eyiti o tọka si [α-32P] UMP si nsp9-His6. (12.9 kDa), eyiti a ko ṣe akiyesi fun awọn ọlọjẹ miiran ti a ṣe idanwo.
HCoV-229E NiRAN-alarija biokemika ati ijuwe virological ti nsp9 NMPylation.(A ati B) Ipa ipa-sobusitireti nucleotide ti a lo ninu iṣesi.Nsp12-His6 ati nsp9-His6 ti wa ni idapo ati idabo ni iwaju ti o yatọ si [α-32P] NTPs ni boṣewa NMPylation assay.(A, oke) Coomassie-abariwon nsp9-His6 niya nipasẹ SDS-PAGE.(A, isalẹ) Autoradiograph ti agbegbe kanna ti jeli.(B) Iṣẹ iṣe ibatan (itumọ ± SEM) ni iwaju cofactor nucleotide ti a yan ni ipinnu lati awọn adanwo ominira mẹta.P≤0.05.(C) Ipa ti awọn ions irin.Afihan ni idanwo NMPylation boṣewa ni iwaju [α-32P] UTP ati awọn ions irin oriṣiriṣi, ọkọọkan pẹlu ifọkansi ti 1 mM.Ni C, oke, Coomassie abariwon nsp9-His6 ti han, ati ni C, isalẹ, a ṣe afihan autoradiography ti o baamu.Iwọn ti amuaradagba ti o ni aami (ni awọn kilodaltons) ni a fihan si apa osi ti A ati C. (D) Fọọmu mutant ti HCoV-229E nsp12-His6 ti o n gbe aropo amino acid ti o wa ni [α-32P] UTP, gẹgẹbi a ti ṣalaye ni Awọn ohun elo ati Awọn ọna.Awọn aami redio nsp9-His6 ti a ṣe ni iṣesi NMPylation ni a rii nipasẹ aworan phosphorylation (D, oke).Iṣẹ iṣe ibatan ti a fiwera pẹlu amuaradagba iru egan (wt) jẹ afihan ni D, ati isalẹ ni a mu bi aropin (± SEM) lati idanwo olominira mẹta.Asterisks tọkasi awọn aropo ti awọn iṣẹku ti ko ni ipamọ.(E) Titer kokoro ni aṣa ti o ga julọ ti awọn sẹẹli p1 ti o gba awọn wakati 24 lẹhin ikolu ti pinnu nipasẹ ayẹwo okuta iranti.Awọn iyipada codon ni agbegbe NiRAN ti ẹda HCoV-229E ti a ṣe ni itọkasi (nọmba ti o ku da lori ipo wọn ni pp1ab).Iyipada-aipe RdRp mutant ojula nsp12_DD4823/4AA ni a lo bi iṣakoso.
Lati le ni oye ti o jinlẹ ti aaye ti nṣiṣe lọwọ ti NiRAN ati pinnu awọn iṣẹku ti o ni ibatan si iṣẹ ṣiṣe ti nsp9-pato NMP transferase, a ṣe itupalẹ iyipada, ninu eyiti a rọpo awọn iṣẹku Konsafetifu ninu awọn ero NiRAN AN, BN ati CN ( 16) O ti wa ni Ala (SI appendix, Figure S2).Ni afikun, ipa ti Konsafetifu Arg-to-Lys tabi Lys-to-Arg awọn aropo ni a ṣe ayẹwo ni awọn ọran meji.Gẹgẹbi iṣakoso (odi), awọn iṣẹku ti kii ṣe tabi kere si ni ipamọ ni agbegbe NiRAN ti coronaviruses ati awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ miiran ni a rọpo pẹlu Ala. Rirọpo K4116A (in motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif) BN) ati D4280A (CN) dinku tabi paapaa yọkuro nsp9 NMPylation nipasẹ nsp12, lakoko ti awọn ọlọjẹ pẹlu awọn aropo Konsafetifu (R4178K) , K4116R) ni idaduro 60% ati 80% ti iṣẹ ṣiṣe wọn, eyiti o tọka si isinmi ti awọn ihamọ lori ẹgbẹ wọn. awọn ẹwọn jẹ ifarabalẹ ti ẹkọ-kẹmikali (Eyaworan 3D).Rirọpo ọpọlọpọ awọn iṣẹku ti o fipamọ E4145A, D4273A, F4281A ati D4283A ko ni ipalara pupọ, ati pe nsp9 UMPylation dinku niwọntunwọnsi.Awọn abajade ti o jọra ni a gba ni awọn aati nsp9 NMPylation ti o kan awọn NTP miiran (Nọmba 3D ati Àfikún SI, Nọmba S3), ifẹsẹmulẹ pe awọn ipa ti a ṣe akiyesi lori awọn aropo amino acid kan pato jẹ ominira ti iru isọdọtun nucleotide ti a lo.Nigbamii ti, a ṣe idanwo ipa ti o ṣeeṣe ti awọn aropo nsp12 wọnyi lori ẹda ti awọn coronaviruses ni aṣa sẹẹli.Ni ipari yii, a lo awọn awoṣe DNA (cDNA) ti o ni ibamu pẹlu jiini ti o yẹ ti a ṣe sinu ọlọjẹ ajesara (23, 24) lati ṣe iyipada awọn sẹẹli 5-7.Titration ti awọn ọmọ-ọmọ ọlọjẹ ajakale ti a ṣejade ninu awọn sẹẹli wọnyi fihan pe pupọ julọ awọn ẹda HCoV-229E NiRAN ko ṣee ṣe (Eya 3E).Ẹgbẹ kan ti awọn iyipada gbogun ti ko le yanju pẹlu awọn omiiran ti o han lati yọkuro tabi dinku iṣẹ ṣiṣe NMP gbigbe ni vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ṣugbọn awọn omiiran miiran meji wa (K4116R, E48045A) . % ni ipamọ?Iṣẹ ṣiṣe NMPylation in vitro wọn ni imọran pe awọn ihamọ afikun wa pẹlu.Bakanna, awọn iyipada meji miiran (R4178K, F4281A) ti o fa idinku iwọntunwọnsi ninu iṣẹ NMPylation in vitro NiRAN ṣe agbejade awọn ọlọjẹ laaye, sibẹsibẹ, awọn ọlọjẹ wọnyi dinku pataki titers nipasẹ ẹda.Ni ibamu pẹlu data iṣẹ ṣiṣe in vitro ti o han ni Nọmba 3D, rirọpo awọn iṣẹku mẹrin miiran ti ko tọju ni coronavirus ati / tabi awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ miiran (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ṣe awọn ọlọjẹ ti o le yanju Awọn ọmọ, botilẹjẹpe nini nini titer ti o dinku niwọntunwọnsi ni akawe si ọlọjẹ iru-igi (olusin 3E).
Lati le ṣe iwadi boya iṣẹ NMP gbigbe NMP ti o ni agbedemeji NiRAN da lori agbegbe RdRp ti nṣiṣe lọwọ, awọn iṣẹku Asp meji ti o ni aabo ti o ni ipa ninu isọdọkan ti awọn ions irin divalent (11) ni RdRp motif C ti rọpo nipasẹ Ala. nsp9 NMPylation iṣẹ rẹ, ti o fihan pe nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ko nilo iṣẹ-ṣiṣe polymerase (SI Àfikún, Figure S4).
Lẹhin idasile iṣẹ ṣiṣe NMP gbigbe-pato nsp9-pato fun nsp12, a gbiyanju lati ṣe afihan NMP-nsp9 adduct nipasẹ iwọn-spectrometry (MS).Ipejuwe ọpọ amuaradagba pipe ti HCoV-229E nsp9 recombinant ṣe afihan tente oke kan ni 12,045 Da (Nọmba 4A).Afikun ti nsp12 ko yi didara nsp9 pada, ti o fihan pe nsp12 ati nsp9 kii yoo ṣe eka iduroṣinṣin labẹ awọn ipo ti a lo (denaturation) (Figure 4A).Ni iwaju UTP ati GTP, wiwọn ibi-aṣeyọri ti o ni awọn nsp9 ati nsp12 ni lẹsẹsẹ fihan pe iwuwo amuaradagba ti UTP gbe 306 Da, ati pe iwuwo amuaradagba ti GTP gbe 345 Da, ti o fihan pe molecule nsp9 kọọkan so UMP tabi GMP kan. (Aworan 4) C ati D).A ṣe akiyesi pe agbara ti o nilo fun NMPylation NTP-mediated NiRAN wa lati NTP hydrolysis ati itusilẹ pyrophosphate.Botilẹjẹpe a ti lo iwọn 10-pupọ molar ti nsp9 (afojusun) ju nsp12 (enzyme) lọ ni ifasẹ yii, o fẹrẹ to pipe NMPylation ti nsp9 ni a ṣe akiyesi, ti o fihan pe ibaraenisepo laarin nsp12 ati nsp9 jẹ igba diẹ, ati pe nsp12 le NMPylate diẹ sii nsp9. in vitro moleku.
NMPylation nikan ti nsp9 ni iwaju nsp12 ati UTP tabi GTP.Ti ṣe afihan ni itusilẹ pipọ pipọpọpọ amuaradagba ti HCoV-229E nsp9 (Afikun SI, Tabili S1) (AD).(A) nsp9 nikan, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 niwaju UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ni iwaju GTP.
Lati pinnu awọn iṣẹku nsp9 UMPylated nipasẹ nsp12, nsp9-UMP ti pin pẹlu trypsin.Awọn peptides ti o yọrisi ni a yapa nipasẹ nano-giga iṣẹ ṣiṣe kiromatogirafi (HPLC) ati ṣe atupale nipasẹ tandem massspectrometry (MS/MS) lori ayelujara.Iṣiro data nipa lilo package sọfitiwia Byonic (Awọn Metiriki Amuaradagba) ṣe afihan UMPylation ti amino acid N-terminal.Eyi ni a fọwọsi pẹlu ọwọ.Iwọn titobi tandem ti peptide iṣaaju [UMP] NNEIMPGK (Afikun SI, Nọmba S5A) ṣe afihan ajẹkù kan ni 421 m/z, nfihan pe UMP sopọ mọ iyokù 1 ti nsp9.
Ni N-terminus ti nsp9, Asn ti wa ni ipamọ laarin awọn ọmọ ẹgbẹ ti Orthocoronavirinae (SI appendix, Figure S6).Botilẹjẹpe a gbagbọ pe N-terminal jc amine nitrogen jẹ olugba ti o ṣeeṣe julọ fun UMP, a pinnu lati gba ẹri afikun ti abuda NMP ni N-terminal.Fun idi eyi, ti kii ṣe NMPylated ati NMPylated N-terminal peptide nsp9 ti a sọ di mimọ nipasẹ HPLC ti wa ni iwaju acetone ati sodium cyanoborohydride.Labẹ awọn ipo wọnyi, awọn amines akọkọ ọfẹ nikan ni a le yipada pẹlu propyl (25).N-terminal nsp9-ti ari peptide pẹlu ọna NNEIMPGK ni awọn amines akọkọ meji, ọkan ni N-terminus ti Asn ati ekeji ni ẹwọn ẹgbẹ ti Lys ni C-terminus.Nitorina, awọn ẹgbẹ propyl le ṣe afihan ni awọn opin mejeeji.Awọn chromatograms ion ti a fa jade ti awọn peptides ti kii ṣe NMPylated jẹ afihan ni afikun SI, Nọmba S5B.Bi o ti ṣe yẹ, N-terminal ati C-terminal (mono) propylated (SI appendix, Figure S5B, Lane oke) ati awọn peptides dipropylated (Afikun SI, Nọmba S5B, ọna isalẹ) le ṣe idanimọ.Apẹrẹ yii yipada pẹlu lilo NMPylated N-terminal peptide ti nsp9.Ni ọran yii, awọn peptides propylated C-terminal nikan ni a le ṣe idanimọ, ṣugbọn awọn peptides propylated N-terminal ati awọn peptides dipropylated ko ni idanimọ (Afikun SI, Nọmba S5C), ti o fihan pe UMP ti gbe lọ si amine akọkọ N-terminal Lati yago fun eyi ẹgbẹ lati ṣiṣe awọn ayipada.
Nigbamii ti, a rọpo (pẹlu Ala tabi Ser) tabi paarẹ awọn iṣẹku ti a fipamọ ni N-terminus ti nsp9 lati ṣalaye awọn ihamọ-ipinnu kan pato.Da lori data MS wa ti o fihan pe NiRAN ṣe agbekalẹ nsp9-NMP adduct pẹlu amine akọkọ ti iyokù N-terminal ti nsp9, a pinnu pe nsp9 NMPylation nilo protease oluwa gbogun (Mpro, nsp5) lati tu silẹ nsp9 N-terminal lati ipilẹṣẹ polyprotein rẹ.Lati ṣe idanwo idawọle yii, a ṣe agbejade amuaradagba ti nsp7-11 ti o ni awọn nsp9 ninu E. coli ati ṣe idanwo NMPylation boṣewa ni iwaju [α-32P] UTP (awọn ohun elo ati awọn ọna).Gẹgẹbi a ṣe han ni Nọmba 5A (ọna 3), iṣaju nsp7-11 ti a ko ge ko ni aami redio pẹlu nsp12.Ni idakeji, ti o ba jẹ pe nsp7-11 ti pin nipasẹ recombinant nsp5 lati tu nsp9 (ati awọn nsps miiran) silẹ lati ipilẹṣẹ, a ri amuaradagba redio ti o nṣikiri pẹlu nsp9, ti o jẹrisi ipari wa pe NiRAN ati N- Selective formation of covalent nsp9-NMP adducts. .Amin akọkọ ebute ti N-terminal Asn (ipo 3825 ni pp1a/pp1ab).Ipari yii tun ni atilẹyin nipasẹ awọn idanwo nipa lilo iṣelọpọ nsp9, eyiti o ni awọn iṣẹku ọkan tabi meji ni ninu N-terminus.Ninu awọn mejeeji, NiRAN-mediated UMPylation ti nsp9 ti parẹ (Afikun SI, Figure S7).Nigbamii ti, a ṣe agbejade amuaradagba pẹlu ọkan tabi meji awọn iṣẹku Asn ti paarẹ lati ọna 3825-NNEIMPK-3832 peptide ni N-terminal ti nsp9.Ni awọn ọran mejeeji, nsp9 UMPylation ti dina patapata (Figure 5B), n pese ẹri afikun pe nsp9 N-terminus gidi n ṣiṣẹ bi olugba NMP.
Sisẹ proteolytic ti nsp9 ati ipa ti awọn iṣẹku N-terminal ni nsp12-mediated UMPylation.(A) nsp9 UMPylation nbeere nsp9 N-terminal ọfẹ kan.Nsp7-11-His6 ti wa ni iṣaju ni 30 °C ni ifipamọ wiwa NMPylation ti o ni UTP ninu niwaju tabi isansa ti recombinant Mpro (nsp5-His6).Lẹhin awọn wakati 3, bẹrẹ idanwo NMPylation nipa fifi nsp12-His6 kun gẹgẹbi a ti ṣalaye ninu Awọn ohun elo ati Awọn ọna.Idahun ti o ni nsp5-His6 (ona 1) ati nsp9-His6 (ọna 2) ni a lo bi iṣakoso.Lẹhin awọn iṣẹju 10, iṣesi naa ti fopin ati pe a ti pin adalu ifasilẹ nipasẹ SDS-PAGE.Amuaradagba jẹ abawọn pẹlu Coomassie Brilliant Blue (A, oke).Iṣaaju Nsp7-11-His6 ati ọja ti a ṣe ilana ti o jẹ abajade ti nsp5-His6 ti o ni ilaja ti np5 ni a fihan ni apa ọtun.Jọwọ ṣakiyesi (nitori iwọn kekere wọn) pe nsp7 ati nsp11-His6 ko ṣe akiyesi ni jeli yii, ati pe iṣesi naa jẹ afikun pẹlu nsp5-His6 (awọn ọna 1 ati 4; ipo nsp5-His6 jẹ itọkasi nipasẹ Circle to lagbara) tabi nsp9-His6 (Lane 2) ni iye kekere ti MBP (itọkasi nipasẹ awọn iyika ṣiṣi) bi awọn idoti ti o ku nitori pe wọn ṣe afihan bi awọn ọlọjẹ fusion MBP (Afikun SI, Table S1).(B) Iyatọ Nsp9-His6 ko ni ọkan tabi meji awọn iṣẹku Asn N-terminal (nọmba iyokù ni ibamu si ipo ti o wa ni pp1a/pp1ab) ati pe a sọ di mimọ ati ti a fi sii pẹlu nsp12-His6 ati [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE ti o ni abawọn pẹlu Coomassie ti han ni oke, B, autoradiograph ti o baamu ti han ni isalẹ.Ipo aami iwuwo molikula (ni kilodaltons) han ni apa osi.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal awọn iṣẹku ti a fipamọ ni a rọpo pẹlu Ala tabi Ser, ati pe iye kanna ti amuaradagba ni a lo ninu ifasẹyin UMPylation ti nsp12-His6 mediated.Awọn ọja ifaseyin ti yapa nipasẹ SDS-PAGE ati abariwon pẹlu Coomassie Brilliant Blue (C, oke), ati nsp9-His6 ti o ni aami redio ni a rii nipasẹ aworan phosphorescence (C, arin).Lilo amuaradagba iru-ẹgan (wt) gẹgẹbi itọkasi (ṣeto si 100%), iṣẹ ṣiṣe NMPylation ibatan (itumọ ± SEM) jẹ iṣiro lati awọn adanwo ominira mẹta.(D) Awọn titers ọlọjẹ ninu aṣa sẹẹli p1 supernatant ti awọn sẹẹli Huh-7 ti o ni akoran pẹlu awọn sẹẹli HCoV-229E iru-ẹgan Huh-7, ati awọn mutanti ti o gbe awọn aropo amino acid ti a yan ni nsp9 ni ipinnu nipasẹ iwadii okuta iranti.Aini-aini atunṣe-pada RdRp agbaso ero C ilọpo meji DD4823/4AA ni a lo bi iṣakoso odi.
N-terminus ti nsp9 (paapaa awọn ipo 1, 2, 3, ati 6) ti wa ni ipamọ pupọ laarin awọn ọmọ ẹgbẹ ti idile idile Orthocoronavirinae (Afikun SI, Nọmba S6).Lati le ṣe iwadi ipa ti o ṣeeṣe ti awọn iṣẹku wọnyi ni nsp12-mediated nsp9 NMPylation, awọn iṣẹku Asn meji ni itẹlera ni N-terminus ti nsp9 ni a rọpo pẹlu Ala tabi Ser (nikan tabi ni apapọ).Ti a bawe pẹlu iru nsp9 egan, rirọpo N3825 pẹlu Ala tabi Ser yorisi diẹ sii ju idinku-meji-meji ni nsp12-mediated UMPylation (Figure 5C).Ni ibamu pẹlu ipari wa pe NMPylation waye ni amine akọkọ N-terminal dipo ẹwọn ẹgbẹ ti aloku N-terminal, a ṣe akiyesi NMPylation ti o ṣe pataki pẹlu rirọpo N3825A ati N3825S.O yanilenu pe, ti Asn keji ba rọpo nipasẹ Ala tabi Ser, nsp9 UMPylation dinku ni agbara diẹ sii (diẹ sii ju awọn akoko 10), lakoko ti rirọpo Ala ni awọn ipo 3, 4, ati 6 ni ipa iwọntunwọnsi lori nsp9 UMPylation (Figure 2). ) .5C).Awọn abajade kanna ni a gba nipa lilo ATP, CTP tabi GTP (Afikun SI, Nọmba S8).Ni apapọ, awọn data wọnyi ṣe afihan ipa pataki ti N2826 (ipo 2 ni nsp9) ni nsp9 NMPylation.
Lati le gba ẹri afikun ti ibamu iṣẹ-ṣiṣe laarin N-terminus ti nsp9 ati NMPylation, a ṣe titete ọkọọkan kan (MSA) ti ọna nsp9 ti idile Coronavirus (ti o yatọ laarin awọn iyokù 104 ati 113) (Afikun SI, Nọmba S6).Ni apapọ, ninu awọn ẹya 47 (ti a mọ ati putative) ti 5 genera ti idile idile Orthocoronavirinae ti o ṣe akoran awọn ẹranko oriṣiriṣi, awọn ẹiyẹ, ati awọn ogun ti nrakò, awọn iṣẹku 8 nikan ni a rii pe o jẹ alaiṣedeede.Awọn iyipada ti o pọ julọ, pẹlu awọn piparẹ ati awọn ifibọ, ni a ṣe akiyesi ni awọn iyipo laarin awọn eroja igbekalẹ Atẹle ti nsp9, bi a ti pinnu nipasẹ awọn ẹkọ igbekalẹ iṣaaju (26 ??28).Awọn iyoku aibikita marun ni a rii ni okun β ati helix α ti apakan C-terminal ti nsp9.Awọn iṣẹku alailẹgbẹ mẹta jẹ apẹrẹ NNE ti ipari N ti nsp9.O ti wa ni han wipe awọn keji Asn ti yi agbaso ero jẹ nikan ni aloku, eyi ti o ti tun pín nipa awọn hypothetical nsp9 ti awọn jina jẹmọ Ọpọlọ coronavirus, ati ki o duro Microhyla letovirus 1 eya ni subfamily Letovarinae ti Alphaletovirus.Itoju awọn iṣẹku ni awọn eroja igbekalẹ keji nsp9 le jẹ onipin nipasẹ awọn ero igbekalẹ lati ṣetọju kika tabi awọn ohun-ini abuda RNA ti a mọ.Sibẹsibẹ, ero yii ko dabi pe o kan si itoju ti NNE, ati ṣaaju ki o to iwadi yii, iru awọn idiwọ ti o ṣe idiwọn iyatọ ti ọna-ọna tripeptide ti wa ni ipamọ patapata.
Lati le pinnu pataki ti nsp9-NMPylation ati itoju NNE ni ẹda coronavirus, a ṣe agbejade awọn ẹda HCoV-229E, eyiti o gbe ẹyọkan tabi ilọpo meji ti awọn iṣẹku nsp9 N-terminal, ti o fihan pe nsp9 NMPylation jẹ ipalara ninu vitro.Ṣaaju ki a to bẹrẹ, a gbiyanju lati dahun ibeere naa boya awọn aropo wọnyi (nitosi aaye nsp8|9 cleavage) ni ipa lori sisẹ proteolytic ti agbegbe C-terminal pp1a.Eto ti awọn iṣelọpọ polyprotein nsp7-11 ti o ni awọn aropo ti o baamu ni N-terminus ti nsp9 ni a ṣe ni E. coli ati ge pẹlu atunbere Mpro.Pipin proteolytic ti awọn aaye mẹrin (pẹlu aaye nsp9 flanking) ko ni ipa ni pataki nipasẹ awọn iyipada ti a ṣe agbekalẹ (SI appendix, Figure S9), laisi awọn iyipada igbekalẹ ninu awọn ọlọjẹ wọnyi ti o dabaru pẹlu Mpro-mediated nsp8|9 cleavage (Tabi miiran) aaye ayelujara.
Awọn sẹẹli Huh-7 ni a yipada pẹlu gigun-jinome-gigun HCoV-229E RNA, fifi koodu Ala tabi Ser fidipo ninu awọn ipamọ NNE tripeptides (N3825, N3826, ati E3827) ni ebute nsp9 N, n fihan pe pupọ julọ awọn iyipada jẹ apaniyan.A ni anfani lati gba ọlọjẹ naa lọwọ nipa rirọpo Ser tabi Ala ti N-terminal Asn (N2835A tabi N2835S), ṣugbọn kuna lati gba ọlọjẹ naa pada pẹlu ẹyọkan ati awọn iyipada meji ni ọna NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Eyaworan 5D).
Awọn abajade wọnyi tọka pe ẹda ti awọn coronaviruses ni aṣa ti ara jẹ ihamọ (kanna tabi iru), diwọn iyipada adayeba ti awọn aaye NMPylation nsp9 ninu ara, ati atilẹyin ipa bọtini ti idahun yii ni igbesi aye ti awọn coronaviruses.
Ninu eto awọn adanwo ti o kẹhin, a ṣe agbejade C-terminal His6 ti a samisi SARS-CoV-2 nsp12 ati nsp9, ati awọn fọọmu mutant meji ti nsp12 ni E. coli.Awọn iṣẹku aaye ti nṣiṣe lọwọ ni awọn agbegbe NiRAN ati RdRp ni a lo ni lẹsẹsẹ Lo Ala dipo (Aworan 6A ati afikun SI, Table S2).K4465 ni SARS-CoV-2 nsp12 ni ibamu si K4135 ni HCoV-229E (Afikun SI, Nọmba S2), eyiti o fihan pe o nilo fun iṣẹ NiRAN ati ẹda HCoV-229E (Figure 3D ati E).Aloku yii tun ni ibamu pẹlu ọlọjẹ iṣọn-ẹjẹ EAV nsp9 K94 iyokù, eyiti a fihan tẹlẹ pe o ṣe pataki fun NiRAN ti ara-UMPylation/ara-GMPylation (16).Gẹgẹbi a ṣe han ni Nọmba 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ni iṣẹ gbigbe UMP ni lilo nsp9 bi sobusitireti, lakoko ti nsp12_K4465A mutant aaye ti nṣiṣe lọwọ ko ṣiṣẹ.Fidipo ilọpo meji ni ọna abuda ti SDD ti RdRp motif C ko ni ipa lori iṣẹ gbigbe UMP (Nọmba 6B), ti o nfihan pe iṣẹ RdRp ko ni ipa taara ni nsp9 UMPylation.Iru data ni a gba nipa lilo CTP, GTP ati ATP (Afikun SI, Nọmba S10).Ni akojọpọ, data wọnyi tọka pe nsp9 NMPylation ti o ni agbedemeji NiRAN ni iṣẹ ṣiṣe Konsafetifu ni awọn coronaviruses ti o ṣojuuṣe oriṣiriṣi oriṣi ti idile idile orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-ilaja NMPylation ti nsp9.(A) Gel SDS-polyacrylamide Coomassie ti nfihan amuaradagba atunko ti a lo ninu idanwo NMPylation.Gẹgẹbi iṣakoso, amuaradagba mutant kan pẹlu fidipo aaye ti nṣiṣe lọwọ ni agbegbe NiRAN (K4465A) ati agbegbe RdRp (DD5152/3AA) ti SARS-CoV-2 nsp12 ni a lo.Nọmba iyokù da lori ipo ni pp1ab.(B) Autoradiograph ti wiwa UMPylation nipa lilo nsp9-His6 ati [α-32P] UTP bi sobusitireti ti nsp12-His6 (iru egan [wt] ati mutant).Iwọn molikula (ni kilodaltons) ti amuaradagba ti a fi aami han ni a fihan ni apa osi.
Awọn ibugbe NiRAN ti wa ni ipamọ ni gbogbogbo ni Nidovirales (16), ti o nfihan pe wọn mu awọn aati enzymatic ṣe pataki fun ẹda Nidovirus.Ninu iwadi yii, a ni anfani lati jẹrisi pe agbegbe NiRAN ti coronavirus n gbe NMP (ti ipilẹṣẹ lati NTP) si nsp9, amuaradagba abuda RNA aramada ti o ni ipa ninu ẹda ọlọjẹ (26 ?? 29), lati pinnu rẹ bi ibi-afẹde adayeba ati alabaṣepọ ti coronavirus RTC.
Agbegbe NiRAN n pin awọn ilana itọka mẹta (AN, BN, ati CN), eyiti o ni nọmba kekere pupọ ti awọn iṣẹku ti o ni aabo ni gbogbo awọn idile ni monophyletic ṣugbọn ti o ni iyatọ pupọ ni aṣẹ Nidovirales (8, 16).Awọn ijinlẹ aipẹ ti fihan pe wọn ni ibatan si ipilẹ si idile ti ko ni ihuwasi ti awọn ọlọjẹ kinase-like protein, eyiti a pe ni akọkọ idile SelO (17, 19, 22, 30, 31).Awọn ọlọjẹ ti o ni ibatan SelO ni awọn agbo kinase, ṣugbọn ko ni ọpọlọpọ awọn iṣẹku aaye ti nṣiṣe lọwọ ni fipamọ ni awọn kinases kilasika (22, 32).Da lori iṣalaye yiyipada ti awọn ohun elo ATP ti o somọ si aaye ti nṣiṣe lọwọ ati iduroṣinṣin nipasẹ awọn ibaraenisepo kan pato, SelO ti ni idawọle ati lẹhinna jẹrisi lati gbe AMP (dipo fosifeti) si sobusitireti amuaradagba (22), lakoko ti ọlọjẹ SelO-bii amuaradagba YdiU ti ni laipe ni a fihan lati ṣe itusilẹ asomọ covalent ti UMP si Tyr ati awọn iṣẹku Rẹ ti awọn sobusitireti amuaradagba oriṣiriṣi (33).
Lati le jẹrisi ati faagun asọtẹlẹ ti awọn iṣẹku aaye ti nṣiṣe lọwọ ti agbegbe coronavirus NiRAN, a lo biokemika ati awọn ọna jiini yiyipada lati ṣe itupalẹ iyipada lori coronavirus nsp12 (Figure 3D ati E ati SI ohun elo, Nọmba S3 ati tabili) S1â S4).Awọn data fihan pe rirọpo ti HCoV-229E K4135, R4178 ati D4280 pẹlu Ala imukuro in vitro NMP transferase aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ati kokoro ẹda ni asa sẹẹli (Figure 3D ati E ati SI appendices, Figure S3), ni atilẹyin niwaju wọn ni NTP γ-fosifeti. (K4135, R4178) ati isọdọkan ti awọn ions irin aaye ti nṣiṣe lọwọ (D4280).Iyipada E4145A ti Glu ti a fipamọ ni iwọn ti ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ ti a sọtẹlẹ lati ṣe iduroṣinṣin ipo K4135 (17) ni a fihan lati yọkuro atunwi gbogun, ṣugbọn iyalẹnu, iṣẹ naa ni idaduro ni in vitro NMPylation assay (Figure 3D and E and Àfikún SI, Aworan S3 Ati Awọn tabili S1-S4).Akiyesi ti o jọra ni a ṣe nigbati iyipada ti o baamu ṣe afihan ni YdiU homolog ti Salmonella typhimurium (E130A) (33).Papọ, data wọnyi ṣe atilẹyin iṣẹ ilana ti iyoku ti a fipamọ ju iṣẹ katalitiki lọ.
Rirọpo aloku Phe ti a fipamọ (F4281A) laarin iwọn nestovirus ni agbegbe HCoV-229E NiRAN (8) yorisi idinku ninu iṣẹ ṣiṣe NMPylation ni vitro ati idinku pataki ninu ẹda ọlọjẹ ni aṣa sẹẹli (Figure 3D, E ati SI) àfikún, olusin S3).Awọn data wa ni ibamu pẹlu iṣẹ ilana pataki ti aloku yii, gẹgẹbi iṣipopada DFG homologous Phe aloku ti o han tẹlẹ.Ni awọn kinases amuaradagba kilasika, o jẹ apakan ti lupu mimu Mg2 + ati iranlọwọ lati pejọ ati ṣe ilana ọpa ẹhin???Ti beere fun iṣẹ ṣiṣe katalitiki ti o munadoko (32, 34).Rirọpo Ala ati Arg fun awọn iṣẹku K4116 (ninu idii preAN), lẹsẹsẹ, imukuro viral ati, bi o ti ṣe yẹ, ni awọn ipa oriṣiriṣi lori iṣẹ gbigbe NMP ni vitro, da lori ẹwọn ẹgbẹ amino acid ti a ṣafihan (Figure 3D Ati E ati awọn ohun elo SI , Aworan S3).Awọn data iṣẹ ṣiṣe wa ni ibamu pẹlu alaye igbekale, ti o nfihan pe iyokù yii ti ṣe agbekalẹ ibaraenisepo pẹlu ATP fosifeti (17).Ni agbegbe NiRAN ti awọn idile ọlọjẹ ti itẹ-ẹiyẹ miiran, ipo ti HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ti tẹdo nipasẹ Lys, Arg tabi Rẹ (8), ti o nfihan pe ihamọ iṣẹ ti iṣẹku pato yii ti ni ihuwasi.Iyipada ti D4188A ati D4283A yọkuro tabi dinku iṣẹ ṣiṣe enzymu ni agbara ati imukuro ẹda ọlọjẹ (Aworan 3).Awọn iṣẹku meji wọnyi ti wa ni ipamọ ni pupọ julọ (ṣugbọn kii ṣe gbogbo) awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ (8), ti n tọka si pataki-ẹbi kan pato ṣugbọn o ṣee ṣe iṣẹ ti kii ṣe katalitiki.Awọn aropo Ala ti ọpọlọpọ awọn iṣẹku Lys ati Asp miiran (K4113A, D4180A, D4197A ati D4273A) ti a ko tọju ni Coronaviridae tabi awọn idile Nestioviridae miiran (8) ni a lo bi awọn idari.Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, awọn aropo wọnyi jẹ ifarada pupọ, pẹlu idinku diẹ ninu iṣẹ ṣiṣe henensiamu ati atunwi gbogun ni awọn igba miiran (Aworan 3 ati afikun SI, Nọmba S3).Lapapọ, data mutagenesis coronavirus jẹ ibamu pupọ pẹlu GMP ti ara ẹni ati yiyipada data jiini ti EAV NiRAN-RdRp (16), ninu eyiti EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) iyokù K94 (ni ibamu si HCoV- 229E K4135) awọn iṣẹ pataki), R124 (ni ibamu si R4178), D132 (ni ibamu si D4188), D165 (ba D4280), F166 (ba F4281).Ni afikun, data mutagenesis HCoV-229E wa ni ibamu pẹlu ati faagun lati awọn alaye jiini ti SARS-CoV ti a royin tẹlẹ (16), gẹgẹ bi o jọra si awọn ti a ṣe akiyesi fun CN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype ṣàpèjúwe -F219A ati HCoV-229E_F4281A (olusin 3 D ati E ati SI àfikún, Figure S3 ati Table S1-S4).
Ti a ṣe afiwe pẹlu awọn orthologs EAV (16), eyiti o ni yiyan ti o han gbangba fun UTP ati GTP (ninu iṣesi NMPylation ti ara ẹni), iwadi wa fihan pe agbegbe coronavirus NiRAN (ti o jẹ aṣoju nipasẹ HCoV-229E ati SARS-CoV-2) le munadoko. gbe Gbogbo awọn NMP mẹrin mẹrin, botilẹjẹpe ààyò diẹ wa fun UMP (Awọn eeya 1 ati 3).Iyatọ kekere ti o kere ju ti sobusitireti NTP kan pato wa ni ibamu pẹlu SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomposite ti a royin laipẹ, ninu eyiti ADP-Mg2+ sopọ mọ aaye ti nṣiṣe lọwọ ti NiRAN, ṣugbọn kii ṣe pẹlu apakan adenine. ti iṣeto ti awọn ibaraẹnisọrọ pato (17).Ninu iwadi wa, iru nucleotide ti a lo ninu ifarahan NMPylation ko ni ipa iyatọ lori iṣẹ-ṣiṣe ti amuaradagba mutant (SI Appendix, Figure S3), ti o fihan pe ko si ọkan ninu awọn iyokù wọnyi ti o ni ibatan si asopọ ti nucleobase kan pato.Ipilẹ igbekalẹ ati pataki ti ibi-aye ti o yatọ ti awọn ayanfẹ isọdọtun NTP ti o yatọ ti a ṣe akiyesi ni awọn agbegbe NiRAN ti awọn coronaviruses ati awọn ọlọjẹ iṣọn-ara wa lati ṣe iwadi;wọn le jẹ otitọ tabi o le jẹ nitori awọn idiwọn ti awọn ẹkọ wọn.Ni lọwọlọwọ, ko le ṣe ipinnu pe iṣẹ ṣiṣe NMPylator ti o pọju ti ọlọjẹ iṣọn-ẹjẹ NiRAN domain (ti a ṣe afiwe si iṣẹ ṣiṣe NMPylation ti ara ẹni ti a ti sọ tẹlẹ) ni yiyan sobusitireti ti o yatọ, ni akiyesi pe ibajọra laarin iṣọn-ẹjẹ ati coronavirus Agbegbe NiRAN wa ni opin rẹ.Ọkọọkan-orisun Afiwe (16).Ti a ṣe afiwe pẹlu pseudokinase SelO, eyiti o nlo Mg2+ bi olupilẹṣẹ, iṣẹ ṣiṣe ti coronavirus ati ọlọjẹ iṣọn-ara NiRAN da lori Mn2+ (16) (Figure 3C ati SI appendix, Figure S1).Igbẹkẹle Mn2+ ati ayanfẹ ti o han gbangba fun UTP jẹ ẹya dani ti awọn NMPylator amuaradagba, ati pe o ti jẹrisi laipẹ ni amuaradagba YdiU ti Salmonella typhimurium, eyiti o ṣe itọsi Mn2 + -igbẹkẹle amuaradagba chaperone UMPylation ti o muna lati daabobo awọn sẹẹli lati ifakalẹ wahala Cell ATP pool ( 33).
Ijọra igbekalẹ ti a ṣalaye laipẹ laarin agbegbe coronavirus NiRAN ati awọn kinases amuaradagba cellular (17, 19) n pese atilẹyin afikun fun agbara NiRAN lati ṣe asopọ NMP ni iṣọkan si awọn ọlọjẹ miiran ti a ti royin ninu iwadii yii.A dojukọ wiwa wa fun awọn ibi-afẹde NiRAN ti o ṣeeṣe lori awọn ọlọjẹ ti a fiwe si nipasẹ HCoV-229E ORF1a, eyiti a mọ lati ṣe iranlọwọ taara tabi laiṣe taara RTC's ORF1b-encoded replicad (12, 35).Awọn adanwo wa n pese ẹri pipe fun imunadoko ati NMPylation pato ti nsp9 (Ọpọtọ 2).Ti a ba lo amuaradagba ibi-afẹde ni afikun molar ti o jẹ awọn akoko 8 si 10 ti o ga ju ti henensiamu (nsp12), o jẹri pe nsp9 jẹ patapata (mono) NMPized (Aworan 4).A pari pe ibaraenisepo laarin nsp12 ati nsp9 jẹ igba diẹ ati pe kii yoo ṣe eka iduroṣinṣin pẹlu nsp9 (ni isansa ti awọn ipin RTC miiran).Ipari yii jẹ atilẹyin nipasẹ awọn iwadii ibaraenisepo amuaradagba lori ọlọjẹ SARS-CoV (35).Ayẹwo MS ṣe idanimọ amine akọkọ ti iyokù N-terminal ti nsp9 gẹgẹbi aaye NMPylation (Afikun SI, Nọmba S5).Ipilẹṣẹ ti phosphoramidate mnu ati N-terminal amino ẹgbẹ ṣe iyatọ si iṣẹ NMPylation ti o ni agbedemeji NiRAN lati inu syringae Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation reaction, eyi ti o ṣe afihan iṣeto ti O-linked AMP ni Ser, Thr, tabi Tyr iyokù Peptide adduct ( 22), ati S. typhimurium YdiU fọọmu O-asopọ (pẹlu Tyr) ati N-linked (pẹlu Rẹ) peptide-UMP adducts.Alaye ti o lopin ti o wa lori idile SelO ti awọn ọlọjẹ tọkasi pe awọn ọmọ ẹgbẹ ti idile amuaradagba nla yii yatọ pupọ ni dida awọn adducts peptide-NMP.Eyi jẹ akiyesi ti o nifẹ ti o yẹ ikẹkọ siwaju sii.
Awọn data ti a gba ninu iwadi yii mu wa lati ṣe akiyesi pe NMPylation ti nsp9 nilo N-terminus ọfẹ kan.Nínú ọ̀rọ̀ ìdàgbàsókè gbogun ti, èyí yóò jẹ́ pípèsè nípasẹ̀ pípa ẹ̀jẹ̀ afẹ́fẹ́fẹ́ ti nsp8|nsp9 ojúlé ìṣàkóso nínú àdàkọ polyprotein pp1a tí Mpro àti pp1ab ṣe alárinà.Ninu ọpọlọpọ awọn coronaviruses, iyatọ laarin aaye kan pato yii (VKLQ | NNEI ni HCoV-229E) ati gbogbo awọn oju opo wẹẹbu Mpro coronavirus miiran jẹ Asn (dipo kuku iyokù kekere miiran, bii Ala, Ser Tabi Gly) gba P1â???Ibi (36).Awọn data cleavage peptide ti a gba ni awọn ẹkọ akọkọ fihan pe ṣiṣe fifọ ti aaye nsp8|nsp9 kere ju ti awọn aaye miiran lọ, ti o nfihan pe 1) aaye pataki yii le ni ipa ilana ni iṣeduro iṣeduro akoko ti C-terminal. pp1a agbegbe, tabi 2) a Ipa pataki ti nsp9 N-terminus ti a fipamọ sinu isọdọtun kokoro (37).Awọn data wa (Aworan 5A) fihan pe fọọmu atunṣe ti nsp9 ti n gbe ọna N-terminal gidi ni NMPized ni imunadoko nipasẹ nsp12.Ọkọọkan flanking N-terminal kuro nipasẹ ifosiwewe Xa (nsp9-His6; Àfikún SI, Table S1) tabi Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A ati SI appendix, Table S1).Ni pataki, iṣaju nsp9-ti o ni awọn nsp7-11-His6 ti a ko ge ti ṣe afihan resistance si NMPylation ti nsp12, eyiti o ni ibamu pẹlu data wa, ti o fihan pe nsp9-NMP adduct ti wa ni akoso nipasẹ N-terminal primary amine (SI appendix, Figure S5) .Lati ni oye ti o jinlẹ nipa pato sobusitireti NiRAN, lẹhinna a dojukọ awọn iṣẹku N-terminal nitosi ti nsp9.Ni isansa ti awọn ọlọjẹ miiran, wọn rọ ni ọna, idilọwọ wọn lati rii ni fọọmu ti ko ni aami ti nsp9 (26 28, 38), ti o nfihan iyatọ adayeba ti o lopin Eyi jẹ nitori ọna pataki-kan pato (kii ṣe ibatan igbekalẹ keji) iṣẹ ti nsp9 N-terminal ajeku.Awọn aropo Ala ti awọn iṣẹku ti a fipamọ ni agbegbe yii (Awọn nọmba 5C ati D ati afikun SI, Nọmba S8) ṣafihan pe N3826 ṣe pataki fun nsp9 NMPylation in vitro, lakoko ti awọn aropo N3825A ati E3827A yori si idinku ninu NMPylation, lakoko ti M3829A ati P3830A fidipo .O han ni ni ipa lori nsp9 NMPylation.Botilẹjẹpe iyipada ti N-terminal Asn (N3825A, N3825S) ni ipa iwọntunwọnsi lori nsp9 NMPylation ati ẹda ọlọjẹ ni aṣa sẹẹli (Figure 5C ati D), piparẹ ilana isale Asn lati N-terminal 3825-NN dipeptide fihan pe o jẹ apaniyan si awọn ọlọjẹ, ti o fihan pe a nilo iyoku Asn kan ṣaaju iyokù miiran ni N-terminus, ni pataki Asn, botilẹjẹpe o dabi pe iyipada awọn iṣẹku ti o jọra le jẹ ki o farada ni apakan (Figure 5B, C, and D).A pinnu pe 3825-NN dipeptide, ni pataki ti o fipamọ ati pataki iyokù N3826 laarin iwọn coronavirus (Afikun SI, Nọmba S6), ṣe idaniloju abuda ti o pe ati iṣalaye ti nsp9 N-terminus ni aaye ti nṣiṣe lọwọ ti NiRAN.
Rirọpo Ala (E3827A) fun Glu ti a fipamọ ti gbogbo awọn idile ni idaduro nsp9 NMPylation in vitro ṣugbọn o jẹ apaniyan si awọn ọlọjẹ ni aṣa sẹẹli (Ọpọlọpọ 5C ati D), n ṣe afihan iṣẹ afikun ti iyokù yii, fun apẹẹrẹ, ni awọn ibaraẹnisọrọ bọtini (NMPylated tabi ti ko yipada ) nsp9 N-terminus ati awọn nkan miiran ti o ni ipa ninu ẹda ọlọjẹ.Awọn iyipada Nsp9 ko ni ipa lori ilana ilana proteolytic ti nsp9 tabi eyikeyi nsps ti o wa nitosi (39) (SI Àfikún, Nọmba S9), ti o nfihan pe awọn apaniyan phenotypes ti ọpọlọpọ awọn iyipada nsp9 ti a ṣe akiyesi ko ni idi nipasẹ dysregulation ti C proteolytic ilana-terminal pp1a agbegbe. .
Awọn data ti o wa loke n pese ẹri pe lẹhin itọju Mpro-mediated ti nsp8|9 aaye fifọ ni pp1a/pp1ab, N-terminus ti nsp9 le jẹ UMPylated (tabi ṣe atunṣe ni apakan pẹlu NMP miiran).Ni afikun, itọju to dara julọ ti N-terminus ti nsp9 (pẹlu ẹyọkan ati awọn iyokù Asn ti o yatọ ninu idile coronavirus) ati awọn data jiini yiyipada ti a gba ninu iwadi yii (Awọn eeya 3E ati 5D) mu wa pinnu pe nsp9 NMPylation ti a ṣalaye jẹ ibatan ti ẹkọ-aye ati pataki fun ẹda coronavirus.Awọn abajade iṣẹ ṣiṣe ti iyipada yii wa lati ṣe iwadi, fun apẹẹrẹ, nipa ti ṣapejuwe tẹlẹ (ti kii ṣe pato) nsp9 (fọọmu ti a ko yipada) iṣẹ abuda RNA (2628).NMPylation N-terminal le tun ni ipa lori ibaraenisepo ti nsp9 pẹlu amuaradagba tabi awọn sobusitireti RNA tabi didasilẹ awọn apejọ ipele mẹrin.Iwọnyi ni a ti ṣe akiyesi ni awọn ijinlẹ igbekalẹ ati pe a ti fi idi rẹ mulẹ pe o ni ibatan si iṣẹ ṣiṣe si ẹda coronavirus, botilẹjẹpe ni pataki ni isansa ti Ni ọran ti iyipada yii (26-ââ29, 40).
Botilẹjẹpe ibi-afẹde ibi-afẹde ti agbegbe NiRAN coronavirus tun nilo lati ṣe afihan ni awọn alaye diẹ sii, data wa fihan pe pato ibi-afẹde amuaradagba ti agbegbe coronavirus NiRAN dín pupọ.Botilẹjẹpe titọju awọn iṣẹku aaye ti nṣiṣe lọwọ (8, 16) ni agbegbe NiRAN ti gbogbo awọn idile nidovirus ṣe atilẹyin iṣẹ ṣiṣe ti NMPylator ti a fipamọ ni awọn ọlọjẹ wọnyi, idanimọ ti awọn iyokuro apo abuda sobusitireti ti agbegbe yii Itoju ati itoju wa lati jẹ ifihan. , ati pe o le yato laarin awọn oriṣiriṣi awọn idile ti awọn idi Nidovirales.Bakanna, awọn ibi-afẹde ti o yẹ ti awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ miiran ko tii pinnu.Wọn le jẹ awọn orthologs latọna jijin ti nsp9 tabi awọn ọlọjẹ miiran, nitori awọn ilana ti o wa ni ita awọn ibugbe ẹda marun ti o wa ni ipamọ gbogbogbo ni awọn ọlọjẹ ti o ni itẹ-ẹiyẹ ko ni aabo (8), pẹlu eto genome laarin Mpro ati NiRAN, Lara wọn, nsp9 wa ninu kòkòrò àrùn fáírọ́ọ̀sì kòrónà.
Ni afikun, a ko le ṣe akoso lọwọlọwọ o ṣeeṣe pe agbegbe NiRAN ni awọn ibi-afẹde afikun (pẹlu cellular).Ni idi eyi, o tọ lati darukọ pe awọn homologues kokoro-arun ti o wa ninu amuaradagba NMPylators (NMPylators) yii (30, 31) dabi pe o ni "awọn olutọsọna oluwa"?NMP ṣe atunṣe ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ cellular lati ṣe ilana tabi imukuro awọn iṣẹ ṣiṣe isalẹ wọn, nitorinaa ṣe ipa kan ninu ọpọlọpọ awọn ilana ti ibi, gẹgẹbi idahun aapọn cellular ati redox homeostasis (22, 33).
Ninu iwadi yii (Awọn nọmba 2 ati 4 ati Afikun SI, Awọn nọmba S3 ati S5), a ni anfani lati fi mule pe nsp12 gbe apakan UMP (NMP) si ipo kan (ti a fipamọ) ni nsp9, lakoko ti awọn ọlọjẹ miiran ko ni iyipada ninu ti a lo Labẹ awọn ipo, asọye daradara (dipo alaimuṣinṣin) pato sobusitireti ni atilẹyin.Ni ibamu pẹlu eyi, ni akawe pẹlu N-terminal nsp9 NMPylation, nsp12 ti ara NMPylation aṣayan iṣẹ-ṣiṣe jẹ kekere pupọ, wiwa rẹ nilo akoko ifihan autoradiography gigun, ati ilosoke 10-agbo ni ifọkansi nsp12 ni a lo.Ni afikun, itupalẹ MS wa kuna lati pese ẹri fun NMPylation ti nsp12, eyiti o ni imọran pe NMPylation ti ara-ašẹ NiRAN jẹ (ti o dara julọ) iṣẹ ṣiṣe keji.Sibẹsibẹ, o yẹ ki o ṣe akiyesi pe awọn ijinlẹ miiran ti pese ẹri alakoko pe ipo AMPylation ti ara ẹni ti NMPylator kokoro le ṣakoso iṣẹ NMPylation wọn lori awọn sobusitireti amuaradagba miiran (22, 33).Nitorinaa, a nilo iwadii diẹ sii lati ṣe iwadii awọn ipa iṣẹ ṣiṣe ti awọn iṣẹ NMPylation ti ara ẹni ti a royin fun EAV nsp9 (16) ati coronavirus nsp12 (iwadi yii), pẹlu ipa ti o dabaa chaperone-bi lori kika ti agbegbe C-terminal RdRp ( 16)).
Ni iṣaaju, ọpọlọpọ awọn idawọle nipa awọn iṣẹ abẹlẹ ti o ṣeeṣe ti agbegbe nidoviral NiRAN ni a ti gbero, pẹlu RNA ligase, RNA -capped guanylate transferase ati iṣẹ amuaradagba amuaradagba (16), ṣugbọn ko si ọkan ninu wọn ti o ni ibamu pẹlu awọn iṣẹ isale ti o wa.Alaye ti o gba ni awọn ipo atẹle jẹ deede akoko kanna laisi ṣiṣe awọn arosinu afikun.Awọn data ti o gba ninu iwadi yii jẹ ibamu julọ pẹlu (ṣugbọn ko le fi idi rẹ mulẹ) pe agbegbe NiRAN ni ipa ninu ipilẹṣẹ ti iṣelọpọ RNA ti o ni amuaradagba.O ti gbagbọ tẹlẹ pe iṣẹ ti agbegbe NiRAN ni 5 ??²-RNA capping tabi awọn aati RNA ligation ko ni fowo nipasẹ iwọnyi ati Atilẹyin data miiran.Nitorinaa, fun apẹẹrẹ, aaye ti nṣiṣe lọwọ ti NiRAN ni a gba pe o kan Asp ti a fipamọ gẹgẹbi ipilẹ gbogbogbo (D252 ni Pseudomonas syringae SelO; D4271 ni HCoV-229E pp1ab; D208 ni SARS-CoV-2 nsp12) (Afikun SI, eeya 2 ).S2) (17, 22, 33), lakoko ti catalysis ninu ATP-ti o gbẹkẹle RNA ligase ati RNA capping enzymu jẹ ti a ṣe nipasẹ enzymu covalent (lysyl-N) - agbedemeji NMP, eyiti o kan iyokù Lys ti kii- Yipada ( 41).Ni afikun, pataki ti o da lori ọna-akọọkan ti coronavirus NiRAN fun awọn ibi-afẹde amuaradagba ti a fipamọ ati iyasọtọ isinmi fun awọn sobusitireti NTP (yanfẹ UTP) ni ilodi si henensiamu alarija ti NiRAN tabi awọn iṣẹ bii ligase RNA.
O han ni, ọpọlọpọ awọn iṣẹ afikun ni a nilo lati rii daju ati, ti o ba jẹri, ṣe alaye lori ipa ti o ṣeeṣe ti nsp9-UMP (nsp9-NMP) ninu iṣelọpọ RNA ti o ni amuaradagba, eyiti yoo sopọ ọpọlọpọ awọn iyanilenu ṣugbọn (titi di isisiyi) awọn ijabọ tẹlẹ royin tẹlẹ. .Awọn akiyesi ti o ya sọtọ.Fun apẹẹrẹ, o ti pinnu pe opin RNA odi-okun ti coronavirus bẹrẹ pẹlu okun oligo (U) kan (42, 43).Akiyesi yii wa ni ibamu pẹlu imọran pe iṣelọpọ ti okun odi-RNA ti bẹrẹ nipasẹ dipọ fọọmu UMPylated ti nsp9 si iru poly(A) (awọn okunfa), eyiti o le ni igbega nipasẹ abuda RNA rẹ Iṣẹ ati / tabi ibaraenisepo pẹlu miiran RTC amuaradagba.Ipin UMP ti a pese nipasẹ nsp9 lẹhinna le ṣee lo bi “alakoko” fun nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, ni lilo iru 3??²-poly(A) ni jiini RNA tabi oligo miiran (A) ti o ni ọkọọkan. ṣiṣẹ bi awoṣe, iru si ẹrọ ti iṣeto fun picornavirus VPg amuaradagba (44).Kini ti imọran ba jẹ "ti kii ṣe deede"????Ibẹrẹ ti iṣelọpọ RNA odi-okun (ti o fa amuaradagba) n pese ọna asopọ si awọn akiyesi, ti o nfihan pe RNA odi-okun coronavirus ni UMP (dipo UTP) ni ipari rẹ (42), eyiti a gba lati tọka pe Nucleic acid Dicer npa opin phosphorylated nipasẹ endonuclease kan pato ti uridine aimọ.Ti a ba fi idi rẹ mulẹ, iṣẹ-ṣiṣe hydrolytic acid nucleic yii le ṣe iranlọwọ lati tu silẹ fọọmu oligomeric UMPylated ti nsp9 lati opin 5 ² ti okun odi ti o nbọ.Ipa ti o ṣeeṣe ti nsp9 ni alakoko amuaradagba tun wa ni ibamu pẹlu awọn iwadii jiini yiyipada iṣaaju, eyiti o ti fihan pe nsp9 (ati nsp8) ṣe ibaraenisepo ni pataki ati ni pataki pẹlu nkan RNA ti iṣe-iṣe cis ti o tọju nitosi opin 3 ti jiini-jiini.45).Gẹgẹbi ijabọ yii, awọn akiyesi iṣaaju wọnyi le tun ṣe atunyẹwo ati faagun nipasẹ iwadii siwaju sii.
Ni akojọpọ, data wa pinnu iṣẹ ṣiṣe kan pato ti aami elenesamu ọlọjẹ ti ara ẹni ti o sopọ mọ RdRp ni N-terminus.Ninu coronavirus, iṣẹ-ṣiṣe UMPylator/NMPylator media media ti NiRAN ti a ṣẹṣẹ ṣe ni a lo lati gbarale Mn2+ ati awọn iṣẹku Asn ti o wa nitosi ati fa dida awọn ifunmọ phosphoramidate (agbara kekere) pẹlu amine akọkọ N-terminal.Nipasẹ Mpro-mediated cleavage ni nsp8|9 aaye fifọ, ibi-afẹde nsp9 le ṣee lo fun NMPylation, ti o nfihan isọdọkan iṣẹ laarin protease ati agbegbe NiRAN, eyiti o tan si RdRp.Itoju awọn iṣẹku bọtini ni aaye nsp12 NiRAN ti nṣiṣe lọwọ ati ibi-afẹde nsp9, ni idapo pẹlu data ti a gba lati awọn coronaviruses meji pẹlu SARS-CoV-2, pese ẹri to lagbara pe nsp9 NMPylation jẹ awọn ẹya Konsafetifu coronavirus tun jẹ igbesẹ bọtini ni ẹda ọlọjẹ.Awọn data ti o wa ti o mu wa pinnu pe ipa kan pato ti fọọmu NMPylated ti nsp9 ninu iṣelọpọ RNA ti o ni amuaradagba jẹ oju iṣẹlẹ ti o tọ fun coronavirus ati awọn ọlọjẹ itẹ-ẹiyẹ miiran, ati NiRAN tun le dojukọ awọn ọlọjẹ miiran ti a ko mọ.Ṣe atunṣe kokoro naa.Gbalejo ibaraenisepo.Ti o ba jẹrisi, ikopa ti awọn alakoko amuaradagba ninu iṣelọpọ RNA gbogun ti yoo pọ si isunmọ ọkọọkan ti MPro/3CLpro ati awọn agbegbe RdRp laarin coronavirus ti a ti rii tẹlẹ ati picornavirus-bi supergroup (9), eyiti o ti ni iṣọkan ni Pisonivirites ti iṣeto laipẹ (9). 46) ni ẹka.
Awọn data wa tun fihan pe ipilẹ, yiyan ati awọn iṣẹ enzymu Konsafetifu ti a damọ ninu iwadii yii le ṣee lo bi awọn ibi-afẹde fun awọn oogun antiviral.Awọn akojọpọ ti o dabaru pẹlu isopọmọ (ati iyipada ti o tẹle) ti nsp9 N-terminus ti a fipamọ sinu aaye ti nṣiṣe lọwọ ti NiRAN ni a le ni idagbasoke si awọn oogun ajẹsara ti o munadoko ati ti o wapọ, ti o dara fun itọju ti ẹranko ati awọn coronaviruses eniyan lati oriṣiriṣi (iha) Awọn akoran. , pẹlu SARS-CoV-2 ati Arun atẹgun atẹgun Aarin Ila-oorun Coronavirus.
Ilana ifaminsi ti amuaradagba coronavirus ti a ṣejade ninu iwadii yii jẹ imudara nipasẹ RT-PCR ni lilo RNA ti o ya sọtọ lati Huh-7 ti o ni arun HCoV-229E tabi Vero E6 ti o ni arun SARS-CoV-2, ati fi sii nipa lilo awọn ilana isunmọ boṣewa.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) tabi pASK3-Ub-CHis6 (47) ikosile fekito (SI Àfikún, Tabili S1 ati S2).Awọn iyipada codon ẹyọkan ni a ṣe agbekalẹ nipasẹ mutagenesis ti o da lori aaye PCR (48).Lati ṣe agbejade amuaradagba idapọ MBP, awọn sẹẹli E. coli TB1 ti yipada pẹlu pilasima pMAL-c2 ti o yẹ (Afikun SI, Table S1).Amuaradagba idapọmọra jẹ mimọ nipasẹ kiromatogirafi ijora amylose ati pe o pin pẹlu ifosiwewe Xa.Lẹhinna, amuaradagba His6-tagged C-terminal jẹ mimọ nipasẹ Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ (49).Lati ṣe agbejade amuaradagba fusion ubiquitin, awọn sẹẹli E. coli TB1 lo apẹrẹ pASK3-Ub-CHis6 plasmid ti o yẹ (SI Appendix, Tables S1 ati S2) ati pCGI plasmid DNA encoding ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Iyipada (47).C-terminal His6-tagged coronavirus amuaradagba jẹ mimọ bi a ti ṣalaye tẹlẹ (50).
Idanwo ara-NMPylation ti HCoV-229E nsp12-His6 ni a ṣe gẹgẹ bi a ti ṣalaye ninu EAV nsp9 (16).Ni kukuru, nsp12-His6 (0.5 µM) ni 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 in µM buffer, NTP pato ati 0.17 µM baamu [α32-P] NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ni 30 °C fun ọgbọn išẹju 30.Ninu gbogbo awọn igbelewọn NMPylation miiran (boṣewa) ti nsp12-mediated nsp9 NMPylation, awọn ipo iṣesi ti wa ni atunṣe bi atẹle: nsp12-His6 (0.05 µM) ati nsp9-His6 (4 µM) ni iwaju 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM itọkasi NTP, ati 0.17 µM ti baamu [α32-P] NTP.Lẹhin ifasilẹ fun awọn iṣẹju 10 ni 30 ° C, a ti dapọ ayẹwo idahun pẹlu SDS-PAGE ayẹwo ayẹwo: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol ati 0.005% bromophen buluu.Awọn amuaradagba ti dina nipasẹ alapapo ni 90 °C fun awọn iṣẹju 5 ati niya nipasẹ 12% SDS-PAGE.Geli ti wa ni tito ati abariwon pẹlu Coomassie Brilliant Blue ojutu (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorized, ati ki o fara si kan phosphorescent aworan iboju fun 20 wakati (lati ri nsp12 lati NMPylation) tabi (o pọju) Awọn wakati 2 (lati ṣe ayẹwo nsp9 NMPylation).Aworan Typhoon 9200 kan (GE Healthcare) ni a lo lati ṣe ọlọjẹ iboju naa ati pe a lo ImageJ lati ṣe itupalẹ agbara ifihan naa.
Fun itupalẹ MS, 1µM nsp12-His6 ati 10 µM nsp9 (laisi hexahistidine tag) ni a lo ninu itupalẹ NMPylation (Afikun SI, Tabili S1) ati ifọkansi ti 500 µM UTP ati GTP ni a lo.Da lori ifọkansi wọn ati didara amuaradagba ti a nireti, eto Waters ACQUITY H-Class HPLC ti o ni ipese pẹlu ọwọn MassPrep kan (Omi) ni a lo lati sọ 1 si 10 µL ti awọn solusan amuaradagba buffered lori ayelujara.Awọn amuaradagba desalted ti wa ni eluted sinu electrospray ion orisun ti Synapt G2Si mass spectrometer (Omi) nipasẹ awọn wọnyi gradient ti saarin A (omi/0.05% formic acid) ati saarin B (acetonitrile/0.045% formic acid), ati awọn iwe otutu jẹ 60 ° C ati oṣuwọn sisan ti 0.1 milimita / min: elution isocratically pẹlu 5% A fun awọn iṣẹju 2, lẹhinna gradient laini kan si 95% B laarin awọn iṣẹju 8, ati ṣetọju 95% B fun awọn iṣẹju 4 miiran.
Awọn ions to dara pẹlu ibiti o pọju ti 500 si 5000 m/z ni a rii.Glu-fibrinopeptide B jẹ iwọn ni gbogbo iṣẹju-aaya 45 fun atunṣe fiseete lọpọlọpọ.Lo sọfitiwia ohun elo MassLynx pẹlu itẹsiwaju MaxEnt1 lati deconvolve ni apapọ spekitiriumu lẹhin yiyọkuro ipilẹ ati didanu.
UMPylated HCoV-229E nsp9 ti jẹ digested nipasẹ fifi titẹ-tẹle-tẹle ti a yipada trypsin (Serva) ati ti a fi sii ni alẹ ni 37 °C.Ọwọn alayipo Chromabond C18WP (nọmba apakan 730522; Macherey-Nagel) ni a lo lati sọ di iyọ ati ṣojumọ awọn peptides.Nikẹhin, peptide ti tuka ni 25 µL ti omi, eyiti o ni 5% acetonitrile ninu ati 0.1% formic acid ninu.
Awọn ayẹwo ni a ṣe atupale nipasẹ MS nipa lilo Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific).Awọn Gbẹhin nanoâ HPLC eto (Dionex), ni ipese pẹlu aṣa opin-agesin 50 cm ??75 μm C18 RP iwe ti o wa pẹlu 2.4 μm magnetic beads (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Sopọ si aaye spectrometer ti o pọju lori ayelujara nipasẹ orisun Proxeon nanospray;ju 6µL ti ojutu tito nkan lẹsẹsẹ trypsin sinu iwọn ila opin inu 300 µm ×??1 cm C18 PepMap iwe iṣaju iṣaju (Thermo Scientific).Lilo omi/0.05% formic acid bi epo, ayẹwo naa jẹ idẹkùn laifọwọyi ati sọ di mimọ ni iwọn sisan ti 6 µL/min.
Awọn gradients wọnyi ti omi / 0.05% formic acid (solvent A) ati 80% acetonitrile / 0.045% formic acid (solvent B) ni a lo lati ṣaṣeyọri ipinya ti awọn peptides tryptic ni iwọn sisan ti 300 nL / min: 4% B fun Awọn iṣẹju 5, lẹhinna 30 A gradient laini si 45% B laarin awọn iṣẹju, ati ilosoke laini kan si 95% epo B laarin iṣẹju 5.So iwe chromatographic pọ si nano-emitter irin alagbara, irin (Proxeon), ki o fun sokiri eluent taara si capillary gbigbona ti spectrometer ti o pọju nipa lilo agbara ti 2,300 V. Ayẹwo iwadi pẹlu ipinnu ti 60,000 ni olutupajuwe Orbitrap ni nkan ṣe pẹlu. pẹlu o kere ju data mẹta MS/MS awọn ọlọjẹ, yọkuro ni agbara fun awọn aaya 30, ni lilo ijamba ijagba ion laini laini tabi iyapa ijamba agbara ti o ga julọ ni idapo pẹlu wiwa orbitrap, ipinnu naa jẹ 7,500.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹjọ-03-2021